Certains ont tenté de discréditer le journal depuis sa publication et depuis les années 1970 le négationniste David Irving a affirmé de manière régulière que le journal n'était pas authentique. Les constantes déclarations publiques de ces négationnistes incitèrent Teresien da Silva à commenter au nom d'Anne Frank en 1999 : "Pour beaucoup de mouvements politiques d'extrême droite, Anne s'avère être un obstacle. Son témoignage personnel de la persécution des juifs et sa mort dans un camp de concentration empêchent la réhabilitation du national socialisme."

  Depuis les années 1950, la négation de la Shoah constitue un crime dans plusieurs pays d'Europe, dont l'Allemagne, et la loi a été utilisée pour prévenir une recrudescence des activités néo-nazies. A Lübeck en 1959, Otto Frank attaqua en justice Lothar Stielau, un professeur d'école, ancien membre des jeunesses hitlériennes, qui avait publié un prospectus scolaire décrivant le journal comme une contrefaçon. La Cour de justice examina le journal et, en 1960, le déclara comme étant authentique. Stielau rétracta ses précédentes déclarations et Otto Frank arrêta la procédure judiciaire.

  En 1958, Simon Wiesenthal fut défié par un groupe de manifestants lors de la représentation théâtrale du Journal d'Anne Frank à Vienne, qui affirmait qu'Anne n'avait jamais existé. Ces manifestants demandèrent à Wiesenthal de prouver l'existence d'Anne en retrouvant l'homme qui l'avait arrêtée. Il commença à chercher Karl Silberbauer et le trouva en 1963. Lors de son interviews, Silberbauer admit directement son rôle, et identifia Anne Frank à partir d'une photographie comme étant l'une des personnes arrêtées. Il fournit un compte rendu complet des évènements et se rappela qu'il avait vidé une valisette pleine de papiers sur le sol. Ses déclarations corroborèrent la version des évènements qui avait précédemment été présentée par des témoins oculaires comme Otto Frank. Aucune charge ne put être retenue contre Silberbauer, qui n'avait fait que suivre les ordres. Les informations qu'il donna ne permirent pas à Wiesenthal de trouver le dénonciateur de la famille Frank, qui reste une énigme pour les historiens.

  En 1976, M. Frank engagea une autre procédure contre Heinz Roth de Francfort, qui avait également publié des pamphlets proclamant que le journal était une contrefaçon. Le juge statua que s'il publiait de nouveaux écrits de ce type, il serait passible de 500 000 Deutsche Mark d'amende et d'une peine de six mois de prison. Deux autres plaintes furent rejetées par des tribunaux allemands en 1978 et 1979 sur base de la liberté d'expression, car la plainte n'avait pas été déposée par une des parties visées par les écrits. La Cour statua dans les deux cas que si la plainte avait été déposée par une partie concernée, comme Otto Frank, une charge pour calomnie aurait pu être retenue.

  La controverse atteignit son sommet avec l'arrestation et le jugement de deux néo-nazis, Ernst Römer et Edgar Geiss, qui furent jugés coupables de produire et de distribuer de la littérature dénonçant le Journal d'Anne Frank comme étant une contrefaçon, sur la plainte d'Otto Frank. Quand ils firent appel de leur condamnation, une équipe d'historiens étudia les documents en collaboration avec Otto Frank, et conclut qu'ils étaient authentiques. En 1978, durant la procédure d'appel des jugements Römer et Geiss, le laboratoire du tribunal criminel allemand (Bundeskriminalamt, BKA) eut pour tâche d'examiner le type de papier et les types d'encres utilisées dans le manuscrit du journal. Bien que ses conclusions aient indiqué que l'encre avec laquelle le journal avait été écrit était utilisée pendant la guerre, le BKA conclut que "les corrections subséquentes appliquées sur les pages volantes ont été écrites avec des stylos à bille noirs, verts et bleus". Bien que le BKA n'ait pas donné plus de précisions à propos de ces supposées corrections au stylo à billes, les négationnistes dénonçant l'authenticité du journal se sont focalisés sur cette phrase, car les stylos à bille ne sont devenus populaires qu'après la Seconde Guerre Mondiale.

  Le BKA publia en juillet 2006 un communiqué de presse dans lequel il déclara que les recherches effectuées en 1980 ne peuvent en aucune manière être utilisées pour remettre en cause l'authenticité du Journal d'Anne Frank.

  En 1986, le Laboratoire national de sciences légales néerlandais de Rijswijk exécuta une autre expertise technique exhaustive du manuscrit. Bien que le BKA fût invité par ce laboratoire à indiquer sur quelles pages volantes il avait détecté des corrections au stylo à bille, celui-ci fut incapable de présenter un seul exemple. Le laboratoire lui-même trouva seulement deux pages de manuscrits rédigés avec de l'encre de stylo à bille, qui avait été ajoutée dans les pages volantes du manuscrit. L'Edition Critique Révisée du Journal d'Anne Frank (publiée en 2003) fournit des images (pages 167-171) de ces deux pages du manuscrit et dans le chapitre résumant les découvertes faites par le Laboratoire National de Sciences Légales hollandais, H.J.J. Hardy écrit à ce sujet :

"Le psychologue et expert en graphologie d'Hambourg Hans Ockleman déclare dans une lettre à la Fondation Anne Frank datée du 27 septembre 1987 que sa mère, Dorothea Ockleman, est l'auteur de ces morceaux de papier écrits au stylo à bille. Elle les écrivit quand elle collabora à l'étude des journaux avec Minna Becker."

  Après la mort d'Otto en 1980, le journal original, ainsi que les lettres et les feuilles volantes, furent réclamés par l'Institut national des documents de guerre des Pays-Bas, qui demanda une étude légale du journal au ministère de la Justice des Pays-Bas en 1986. Ils comparèrent le manuscrit et plusieurs exemplaires connus. Ils conclurent qu'ils concordaient mais aussi que le papier, la colle et l'encre utilisés étaient disponibles à l'époque à laquelle le journal est supposé avoir été écrit. Leur conclusion finale confirma l'authenticité du journal comme le fit également la Cour régionale de Hambourg le 23 mars 1990.

  Néanmoins, certains négationnistes ont persisté dans leurs affirmations selon lesquelles le journal est une contrefaçon. En 1991, Robert Faurisson et Siegfried Verbeke produisent un livret intitulé : Le Journal d'Anne Frank : une approche critique.  Ils déclarent qu'Otto Frank était l'auteur du journal, basé sur le fait que le journal contient plusieurs contradictions, que se cacher dans l'Annexe aurait été impossible et que le style et l'écriture d'Anne Frank ne seraient pas ceux d'une adolescente.

  En décembre 1993, la maison d'Anne Frank à Amsterdam et la Fondation Anne Frank de Bâle déclenchèrent une action au civil de manière à interdire la poursuite de la distribution du livret Le Journal d'Anne Frank : une Approche Critique aux Pays-Bas. Le 9 décembre 1998, la Cour du District d'Amsterdam statua en faveur des plaignants, rendant hors la loi tout déni concernant l'authenticité du journal, toute distribution des publications de même nature et imposa une amende de 25 000 florins par contravention constatée.